library(Seurat)
Loading required package: ggplot2
Loading required package: cowplot
package ‘cowplot’ was built under R version 3.5.2
Attaching package: ‘cowplot’
The following object is masked from ‘package:ggplot2’:
ggsave
Loading required package: Matrix
library(dplyr)
Attaching package: ‘dplyr’
The following objects are masked from ‘package:stats’:
filter, lag
The following objects are masked from ‘package:base’:
intersect, setdiff, setequal, union
# Load the PBMC dataset
pbmc.data <- Read10X(data.dir = "~/Box Sync/laptop_folders/Willenbring/Feng Single Cell/willenbringh/FC_102418_analysis/filtered_gene_bc_matrices/mm10/")
# Examine the memory savings between regular and sparse matrices
dense.size <- object.size(x = as.matrix(x = pbmc.data))
dense.size
1423338192 bytes
sparse.size <- object.size(x = pbmc.data)
sparse.size
453499832 bytes
dense.size/sparse.size
3.1 bytes
pbmc <- CreateSeuratObject(raw.data = pbmc.data, min.cells = 3, min.genes = 200,
project = "10X_PBMC")
# The number of genes and UMIs (nGene and nUMI) are automatically calculated
# for every object by Seurat. For non-UMI data, nUMI represents the sum of
# the non-normalized values within a cell We calculate the percentage of
# mitochondrial genes here and store it in percent.mito using AddMetaData.
# We use object@raw.data since this represents non-transformed and
# non-log-normalized counts The % of UMI mapping to MT-genes is a common
# scRNA-seq QC metric.
mito.genes <- grep(pattern = "^mt-", x = rownames(x = pbmc@data), value = TRUE)
percent.mito <- Matrix::colSums(pbmc@raw.data[mito.genes, ])/Matrix::colSums(pbmc@raw.data)
# AddMetaData adds columns to object@meta.data, and is a great place to
# stash QC stats
pbmc <- AddMetaData(object = pbmc, metadata = percent.mito, col.name = "percent.mito")
VlnPlot(object = pbmc, features.plot = c("nGene", "nUMI", "percent.mito"), nCol = 3)
# GenePlot is typically used to visualize gene-gene relationships, but can
# be used for anything calculated by the object, i.e. columns in
# object@meta.data, PC scores etc. Since there is a rare subset of cells
# with an outlier level of high mitochondrial percentage and also low UMI
# content, we filter these as well
par(mfrow = c(1, 2))
GenePlot(object = pbmc, gene1 = "nUMI", gene2 = "percent.mito")
GenePlot(object = pbmc, gene1 = "nUMI", gene2 = "nGene")
# We filter out cells that have unique gene counts over 2,500 or less than
# 200 Note that low.thresholds and high.thresholds are used to define a
# 'gate'. -Inf and Inf should be used if you don't want a lower or upper
# threshold.
pbmc <- FilterCells(object = pbmc, subset.names = c("nGene", "percent.mito"),
low.thresholds = c(200, -Inf), high.thresholds = c(8000, 0.50))
pbmc <- NormalizeData(object = pbmc, normalization.method = "LogNormalize",
scale.factor = 10000)
Performing log-normalization
0% 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100%
[----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|
**************************************************|
pbmc <- FindVariableGenes(object = pbmc, mean.function = ExpMean, dispersion.function = LogVMR,
x.low.cutoff = 0.0125, x.high.cutoff = 3, y.cutoff = 0.5)
Calculating gene means
0% 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100%
[----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|
**************************************************|
Calculating gene variance to mean ratios
0% 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100%
[----|----|----|----|----|----|----|----|----|----|
**************************************************|
pbmc <- ScaleData(object = pbmc, vars.to.regress = c("nUMI", "percent.mito"))
Regressing out: nUMI, percent.mito
|
| | 0%
|
|= | 1%
|
|== | 2%
|
|=== | 3%
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|==== | 4%
|
|===== | 5%
|
|====== | 6%
|
|======= | 7%
|
|======== | 8%
|
|========= | 9%
|
|========== | 10%
|
|=========== | 11%
|
|============ | 12%
|
|============= | 13%
|
|============== | 14%
|
|=============== | 15%
|
|================ | 16%
|
|================= | 17%
|
|================== | 18%
|
|=================== | 19%
|
|==================== | 20%
|
|===================== | 21%
|
|====================== | 22%
|
|======================= | 23%
|
|======================== | 24%
|
|========================= | 25%
|
|========================== | 26%
|
|=========================== | 27%
|
|============================ | 28%
|
|============================= | 29%
|
|============================== | 30%
|
|=============================== | 31%
|
|================================ | 32%
|
|================================= | 33%
|
|================================== | 34%
|
|=================================== | 35%
|
|==================================== | 36%
|
|===================================== | 37%
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|====================================== | 38%
|
|======================================= | 39%
|
|======================================== | 40%
|
|========================================= | 41%
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|========================================== | 42%
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|=========================================== | 43%
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|============================================ | 44%
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|============================================= | 45%
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|============================================== | 46%
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|=============================================== | 47%
|
|================================================ | 48%
|
|================================================= | 49%
|
|================================================== | 50%
|
|=================================================== | 51%
|
|==================================================== | 52%
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|===================================================== | 53%
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|====================================================== | 54%
|
|======================================================= | 55%
|
|======================================================== | 56%
|
|========================================================= | 57%
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|========================================================== | 58%
|
|=========================================================== | 59%
|
|============================================================ | 60%
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|============================================================= | 61%
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|============================================================== | 62%
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|=============================================================== | 63%
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|================================================================ | 64%
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|================================================================= | 65%
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|================================================================== | 66%
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|=================================================================== | 67%
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|==================================================================== | 68%
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|===================================================================== | 69%
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|====================================================================== | 70%
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|======================================================================= | 71%
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|======================================================================== | 72%
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|========================================================================= | 73%
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|========================================================================== | 74%
|
|=========================================================================== | 75%
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|============================================================================ | 76%
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|============================================================================= | 77%
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|============================================================================== | 78%
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|=============================================================================== | 79%
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|================================================================================ | 80%
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|================================================================================= | 81%
|
|================================================================================== | 82%
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|=================================================================================== | 83%
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|==================================================================================== | 84%
|
|===================================================================================== | 85%
|
|====================================================================================== | 86%
|
|======================================================================================= | 87%
|
|======================================================================================== | 88%
|
|========================================================================================= | 89%
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|========================================================================================== | 90%
|
|=========================================================================================== | 91%
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|============================================================================================ | 92%
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|============================================================================================= | 93%
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|============================================================================================== | 94%
|
|=============================================================================================== | 95%
|
|================================================================================================ | 96%
|
|================================================================================================= | 97%
|
|================================================================================================== | 98%
|
|=================================================================================================== | 99%
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|====================================================================================================| 100%
Time Elapsed: 34.7452981472015 secs
Scaling data matrix
|
| | 0%
|
|====== | 6%
|
|=========== | 11%
|
|================= | 17%
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|====================== | 22%
|
|============================ | 28%
|
|================================= | 33%
|
|======================================= | 39%
|
|============================================ | 44%
|
|================================================== | 50%
|
|======================================================== | 56%
|
|============================================================= | 61%
|
|=================================================================== | 67%
|
|======================================================================== | 72%
|
|============================================================================== | 78%
|
|=================================================================================== | 83%
|
|========================================================================================= | 89%
|
|============================================================================================== | 94%
|
|====================================================================================================| 100%
pbmc <- RunPCA(object = pbmc, pc.genes = pbmc@var.genes, do.print = TRUE, pcs.print = 1:5,
genes.print = 5)
[1] "PC1"
[1] "Igfbp7" "Cp" "C3" "Trf" "Tmem176b"
[1] ""
[1] "Plac8" "Phgr1" "Lgals4" "Ctse" "Mgst3"
[1] ""
[1] ""
[1] "PC2"
[1] "Ambp" "Sftpd" "Scara3" "Gsta3" "Hhex"
[1] ""
[1] "Ccdc80" "Axl" "Aebp1" "Col1a2" "Vim"
[1] ""
[1] ""
[1] "PC3"
[1] "Birc5" "2810417H13Rik" "Ccna2" "Cdca3" "Pbk"
[1] ""
[1] "Btg2" "Osgin1" "Klf6" "Mt2" "St3gal5"
[1] ""
[1] ""
[1] "PC4"
[1] "Ttr" "Sepp1" "Fga" "Gjb1" "Lrg1"
[1] ""
[1] "Anxa3" "Ccnd1" "Phgdh" "Cxcl16" "Basp1"
[1] ""
[1] ""
[1] "PC5"
[1] "Dhrs7" "Tmsb10" "Ndrg1" "Fabp5" "Bnip3"
[1] ""
[1] "Gsta3" "Gsto1" "Car2" "Cbr1" "Lbp"
[1] ""
[1] ""
VizPCA(object = pbmc, pcs.use = 1:12)
PCAPlot(object = pbmc, dim.1 = 1, dim.2 = 2)
PCAPlot(object = pbmc, dim.1 = 1, dim.2 = 3)
PCAPlot(object = pbmc, dim.1 = 2, dim.2 = 3)
pbmc <- ProjectPCA(object = pbmc, do.print = FALSE)
PCHeatmap(object = pbmc, pc.use = 1:4, cells.use = 200)
#dim(0, do.balanced = TRUE, label.columns = FALSE)
marker_genes = c("Hnf4a", "Alb", "Fah", "Krt8", "Krt18", "G6pc", "Sox9", "Krt7", "Krt19", "Epcam", "Onecut1", "Afp", "Xist")
vlnPlot(pbmc,c("Hnf4a", "Alb", "Fah"))
'vlnPlot' is deprecated.
Use 'VlnPlot' instead.
See help("Deprecated") and help("Seurat-deprecated").
pbmc <- FindClusters(object = pbmc, reduction.type = "pca", dims.use = 1:5, resolution = 0.6, print.output = 0, save.SNN = TRUE)
pbmc <- RunTSNE(object = pbmc, dims.use = 1:10, do.fast = TRUE)
TSNEPlot(object = pbmc)
PrintFindClustersParams(object = pbmc)
Parameters used in latest FindClusters calculation run on: 2019-02-19 14:19:46
=============================================================================
Resolution: 0.6
-----------------------------------------------------------------------------
Modularity Function Algorithm n.start n.iter
1 1 100 10
-----------------------------------------------------------------------------
Reduction used k.param prune.SNN
pca 30 0.0667
-----------------------------------------------------------------------------
Dims used in calculation
=============================================================================
1 2 3 4 5
VlnPlot(object = pbmc, features.plot = c("nGene", "nUMI", "percent.mito"), nCol = 3)
#install.packages( "devtools" )
#devtools::install_github( "anders-biostat/JsRCom" )
#devtools::install_github( "anders-biostat/sleepwalk" )
library(sleepwalk)
#sleepwalk(data.frame(pbmc@dr[["tsne"]]@cell.embeddings), featureMatrices = data.matrix(t(pbmc@data)))
sleepwalk(as.matrix(pbmc@dr[["tsne"]]@cell.embeddings), featureMatrices = as.matrix(t(pbmc@data)))
Estimating 'maxdist' for feature matrix 1
WebSocket opened
DotPlot(pbmc, marker_genes)
#library(MAST)
#pbmc=buildClusterTree(pbmc,do.reorder = TRUE,reorder.numeric = TRUE,pcs.use = 1:11)
#plotClusterTree(pbmc)
singler = CreateSinglerObject(pbmc.data, annot = NULL, project.name="MCA", min.genes = 0,
technology = "10X", species = "Mouse", citation = "",
ref.list = list(), normalize.gene.length = F, variable.genes = "de",
fine.tune = T, do.signatures = T, clusters = NULL, do.main.types = T,
reduce.file.size = T, numCores = SingleR.numCores)
[1] "Dimensions of counts data: 27997x6344"
[1] "Annotating data with Immgen..."
[1] "Variable genes method: de"
[1] "Number of DE genes:3784"
[1] "Number of cells: 6344"
[1] "Fine-tuning round on top cell types (using 11 CPU cores):"
| | 0%, ETA NA
|
| | 1%, ETA 03:08
|
|= | 1%, ETA 03:13
|
|= | 1%, ETA 04:24
|
|= | 1%, ETA 04:41
|
|= | 1%, ETA 05:26
|
|= | 1%, ETA 06:17
|
|= | 2%, ETA 06:20
|
|== | 2%, ETA 06:24
|
|== | 2%, ETA 06:54
|
|== | 2%, ETA 07:03
|
|== | 2%, ETA 07:25
|
|== | 2%, ETA 07:35
|
|== | 2%, ETA 08:34
|
|== | 3%, ETA 08:27
|
|=== | 3%, ETA 08:09
|
|=== | 3%, ETA 07:27
|
|=== | 4%, ETA 07:09
|
|=== | 4%, ETA 07:03
|
|==== | 4%, ETA 07:02
|
|==== | 4%, ETA 07:13
|
|==== | 4%, ETA 07:28
|
|==== | 4%, ETA 07:45
|
|==== | 4%, ETA 08:03
|
|==== | 4%, ETA 08:14
|
|==== | 5%, ETA 08:19
|
|==== | 5%, ETA 08:35
|
|==== | 5%, ETA 08:45
|
|==== | 5%, ETA 08:51
|
|==== | 5%, ETA 09:10
|
|===== | 5%, ETA 09:21
|
|===== | 5%, ETA 09:32
|
|===== | 5%, ETA 09:38
|
|===== | 5%, ETA 09:46
|
|===== | 5%, ETA 09:54
|
|===== | 5%, ETA 10:06
|
|===== | 6%, ETA 10:05
|
|===== | 6%, ETA 10:15
|
|===== | 6%, ETA 10:21
|
|===== | 6%, ETA 10:27
|
|===== | 6%, ETA 10:39
|
|===== | 6%, ETA 10:48
|
|===== | 6%, ETA 10:57
|
|===== | 6%, ETA 11:05
|
|====== | 6%, ETA 11:04
|
|====== | 6%, ETA 11:14
|
|====== | 6%, ETA 11:30
|
|====== | 6%, ETA 11:40
|
|====== | 6%, ETA 11:46
|
|====== | 7%, ETA 11:44
|
|====== | 7%, ETA 11:20
|
|======= | 7%, ETA 10:54
|
|======= | 8%, ETA 10:38
|
|======= | 8%, ETA 10:37
|
|======= | 8%, ETA 10:41
|
|======= | 8%, ETA 10:47
|
|======= | 8%, ETA 10:50
|
|======= | 8%, ETA 10:53
|
|======= | 8%, ETA 10:58
|
|======= | 8%, ETA 11:02
|
|======== | 8%, ETA 11:04
|
|======== | 8%, ETA 11:02
|
|======== | 9%, ETA 11:01
|
|======== | 9%, ETA 11:04
|
|======== | 9%, ETA 11:07
|
|======== | 9%, ETA 11:13
|
|======== | 9%, ETA 11:18
|
|======== | 9%, ETA 11:25
|
|======== | 9%, ETA 11:31
|
|======== | 9%, ETA 11:36
|
|======== | 9%, ETA 11:40
|
|======== | 9%, ETA 11:45
|
|======== | 9%, ETA 11:48
|
|======== | 9%, ETA 11:56
|
|========= | 9%, ETA 11:56
|
|========= | 10%, ETA 11:59
|
|========= | 10%, ETA 12:08
|
|========= | 10%, ETA 12:13
|
|========= | 10%, ETA 12:27
|
|========= | 10%, ETA 12:30
|
|========= | 10%, ETA 12:39
|
|========= | 10%, ETA 12:49
|
|========= | 10%, ETA 12:50
|
|========= | 10%, ETA 13:06
|
|========= | 10%, ETA 12:55
|
|========= | 11%, ETA 12:38
|
|========== | 11%, ETA 12:37
|
|========== | 11%, ETA 12:23
|
|========== | 11%, ETA 12:07
|
|========== | 11%, ETA 11:55
|
|========== | 12%, ETA 11:59
|
|========== | 12%, ETA 12:00
|
|=========== | 12%, ETA 11:58
|
|=========== | 12%, ETA 12:02
|
|=========== | 12%, ETA 12:04
|
|=========== | 12%, ETA 12:01
|
|=========== | 12%, ETA 12:04
|
|=========== | 12%, ETA 12:04
|
|=========== | 12%, ETA 11:59
|
|=========== | 13%, ETA 11:59
|
|=========== | 13%, ETA 12:01
|
|=========== | 13%, ETA 12:03
|
|============ | 13%, ETA 12:05
|
|============ | 13%, ETA 12:06
|
|============ | 13%, ETA 12:06
|
|============ | 13%, ETA 12:06
|
|============ | 13%, ETA 12:06
|
|============ | 13%, ETA 12:12
|
|============ | 13%, ETA 12:15
|
|============ | 13%, ETA 12:20
|
|============ | 13%, ETA 12:22
|
|============ | 13%, ETA 12:26
|
|============ | 13%, ETA 12:31
|
|============ | 14%, ETA 12:31
|
|============ | 14%, ETA 12:33
|
|============ | 14%, ETA 12:41
|
|============ | 14%, ETA 12:47
|
|============ | 14%, ETA 12:51
|
|============ | 14%, ETA 13:11
|
|============= | 14%, ETA 13:06
|
|============= | 14%, ETA 12:56
|
|============= | 14%, ETA 12:44
|
|============= | 15%, ETA 12:42
|
|============= | 15%, ETA 12:31
|
|============= | 15%, ETA 12:30
|
|============== | 15%, ETA 12:27
|
|============== | 15%, ETA 12:29
|
|============== | 15%, ETA 12:31
|
|============== | 15%, ETA 12:31
|
|============== | 15%, ETA 12:32
|
|============== | 15%, ETA 12:37
|
|============== | 16%, ETA 12:36
|
|============== | 16%, ETA 12:36
|
|============== | 16%, ETA 12:37
|
|============== | 16%, ETA 12:42
|
|============== | 16%, ETA 12:42
|
|============== | 16%, ETA 12:46
|
|============== | 16%, ETA 12:46
|
|============== | 16%, ETA 12:52
|
|============== | 16%, ETA 12:57
|
|=============== | 16%, ETA 12:57
|
|=============== | 16%, ETA 13:02
|
|=============== | 16%, ETA 13:07
|
|=============== | 16%, ETA 13:11
|
|=============== | 16%, ETA 13:18
|
|=============== | 16%, ETA 13:23
|
|=============== | 16%, ETA 13:27
|
|=============== | 16%, ETA 13:31
|
|=============== | 16%, ETA 13:34
|
|=============== | 17%, ETA 13:34
|
|=============== | 17%, ETA 13:35
|
|=============== | 17%, ETA 13:38
|
|=============== | 17%, ETA 13:38
|
|=============== | 17%, ETA 13:41
|
|=============== | 17%, ETA 13:51
|
|=============== | 17%, ETA 13:47
|
|================ | 17%, ETA 13:37
|
|================ | 17%, ETA 13:28
|
|================ | 18%, ETA 13:26
|
|================ | 18%, ETA 13:15
|
|================ | 18%, ETA 13:06
|
|================ | 18%, ETA 13:03
|
|================= | 18%, ETA 12:59
|
|================= | 19%, ETA 12:56
|
|================= | 19%, ETA 12:56
|
|================= | 19%, ETA 12:54
|
|================= | 19%, ETA 12:51
|
|================= | 19%, ETA 12:46
|
|================= | 19%, ETA 12:43
|
|================= | 19%, ETA 12:43
|
|================== | 19%, ETA 12:41
|
|================== | 20%, ETA 12:42
|
|================== | 20%, ETA 12:43
|
|================== | 20%, ETA 12:44
|
|================== | 20%, ETA 12:46
|
|================== | 20%, ETA 12:48
|
|================== | 20%, ETA 12:50
|
|================== | 20%, ETA 12:51
|
|================== | 20%, ETA 12:52
|
|================== | 20%, ETA 12:51
|
|================== | 20%, ETA 12:53
|
|================== | 20%, ETA 12:55
|
|================== | 20%, ETA 13:00
|
|================== | 20%, ETA 13:02
|
|================== | 20%, ETA 13:07
|
|================== | 20%, ETA 13:09
|
|================== | 20%, ETA 13:14
|
|================== | 21%, ETA 13:14
|
|================== | 21%, ETA 13:17
|
|=================== | 21%, ETA 13:20
|
|=================== | 21%, ETA 13:18
|
|=================== | 21%, ETA 13:11
|
|=================== | 21%, ETA 12:58
|
|=================== | 22%, ETA 12:51
|
|==================== | 22%, ETA 12:46
|
|==================== | 22%, ETA 12:48
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temp = (as.matrix(pbmc.data))
hist(log2(colSums(temp))+1, main="sum of counts for all cells")
hist(log2(rowSums(temp))+1, main= "sum of counts for all genes")
#which cells express Alb above a certain point
hist(log2(temp[rownames(temp)== "Alb", ]+1))
hist(log2(temp[rownames(temp)== "Epcam", ]+1))
hist(log2(temp[ rownames(temp) == "Epcam", which(temp[rownames(temp)== "Sox9", ]>4)]+1))
hist(log2(temp[rownames(temp)== "Xist", ]+1))
hist(log2(temp[ rownames(temp) == "Xist", which(temp[rownames(temp)== "Sox9", ]>4)]+1))
hist(log2(temp[rownames(temp)== "Hnf4a", ]+1))
hist(log2(temp[rownames(temp)== "Onecut1", ]+1))
hist(log2(temp[rownames(temp)== "Sox9", ]+1))
temp3 = temp[which(rownames(temp) %in% marker_genes), ]
library(pheatmap)
pheatmap(log2(temp3+1))
temp6 = apply(temp, 2, function (x) (x+0.00000000000000000000000000001)/sum(x))
genes expressing Albumin don’t express epcam much genes expressing epcam have some albumin expression
alb_exp = temp6[, which(temp6 [which(rownames(temp6)=="Alb"),]>0)]
alb_exp_markers = alb_exp[which(rownames(alb_exp) %in% marker_genes), ]
pheatmap(log2(alb_exp_markers))
epcam_exp = temp6[, which(temp6 [which(rownames(temp6)=="Epcam"),]>0)]
epcam_exp_markers = epcam_exp[which(rownames(epcam_exp) %in% marker_genes), ]
pheatmap(log2(epcam_exp_markers))
singler = SingleR(method = "single", sc_data, ref_data, types, clusters = NULL,
genes = "de", quantile.use = 0.8, p.threshold = 0.05,
fine.tune = TRUE, fine.tune.thres = 0.05, sd.thres = 1,
do.pvals = T, numCores = SingleR.numCores)